在水產(chǎn)動物病原微生物檢測中的應(yīng)用

　　豚鼠氣單胞菌是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，能導(dǎo)致水產(chǎn)動物敗血癥、腸炎、體表潰瘍和豎鱗病。辛志明制備出3株抗豚鼠氣單胞菌的單克隆抗體，并對單抗1F10進(jìn)行了膠體金標(biāo)記，制備了豚鼠氣單胞菌膠體金免疫層析檢測試紙條。該方法特異性強(qiáng)，檢測靈敏度為100萬CFU/mL，結(jié)果顯示時間小于5min，適用于基層生產(chǎn)推廣應(yīng)用。黃藝丹等采用高度特異的抗豚鼠氣單胞菌單克隆抗體3F3和2C9C3及膠體金標(biāo)記技術(shù)，通過雙抗體夾心法(單克隆抗體-抗原-單克隆抗體)，建立了超靈敏膠體金檢測方法。該法可檢測活菌液和滅活菌液，   低檢出率為1.71萬CFU/mL，特異性高，重復(fù)性好，檢測時間快，操作簡便結(jié)果直觀，為水產(chǎn)上豚鼠氣單胞菌病的檢測提供了   便捷和準(zhǔn)確的方法。
　　溫和氣單胞菌(A.sobria)是一種淡水菌，常見于池塘、湖泊、河流等多種水域，流行性強(qiáng)，水產(chǎn)動物感染后死亡率高，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。梁明龍建立的檢測溫和氣單胞菌的膠體金試紙條可在10min內(nèi)完成對溫和氣單胞菌的檢測，   小檢出限為100萬CFU/mL。該檢測方法、準(zhǔn)確、靈敏、操作簡便，適合非人員在現(xiàn)場檢測。
　　嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發(fā)性致病菌，為條件致病菌，是一種典型的人一獸一魚共患病病原菌，可引起多種水產(chǎn)動物的敗血癥和人類腹瀉。辛志明等用直徑20nm的膠體金標(biāo)記抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體1A5，并以其作為檢測抗體噴涂在金標(biāo)墊上，以抗嗜水氣單胞菌單克隆抗體1F3和羊抗鼠抗體作為捕獲抗體分別噴涂在硝酸纖維素膜的T線和C線上，建立了檢測嗜水氣單胞菌的膠體金試紙條，并用該試紙條檢測滅活與血清混合的模擬樣本，顯示該試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)10萬CFU/mL，檢測時間小于5min，適合基層生產(chǎn)一線的臨床檢測。
　　遲緩愛德華菌又稱遲鈍愛德華氏菌，是魚類、兩棲類、爬行類動物的重要致病菌。由該菌引起的水生動物稱為遲緩愛德華菌病，可導(dǎo)致較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，為我國的3類水生動物疫病。秦璞，胡曉等制備了遲鈍愛德華菌膠體金檢測試紙并對其性能進(jìn)行檢測，結(jié)果表明所研制的試紙?zhí)禺愋粤己茫瑢Υ竽c桿菌、金黃色葡萄球菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌等常見或病原菌進(jìn)行檢測未出現(xiàn)交叉反應(yīng)；敏感度達(dá)到10萬CFU/mL，反應(yīng)時間僅為5~10min，可以用于感染遲鈍愛德華氏菌大菱郵腹水的檢測，具有操作簡便、特異性強(qiáng)、等特點。辛志明以納米膠體金顆粒標(biāo)記抗遲緩愛德華菌單克隆抗體3A7，并以其作為檢測抗體，以抗遲緩愛德華菌單克隆抗體4F11和羊抗鼠抗體作為捕獲抗體，建立了遲緩愛德華菌的膠體金免疫層析檢測方法。該試紙條靈敏度可達(dá)10萬CFU/mL，且特異性強(qiáng)，檢測時間低于20min，適合基層生產(chǎn)推廣應(yīng)用。
　　哈維弧菌(Vibrio　harveyi)是發(fā)光性弧菌病的主要病原菌，能夠感染多種海洋脊椎動物和無脊椎動物。Sithigorngul等制備了兩株抗哈維氏弧菌的單克隆抗體(VH4、VH5)和一株多克隆抗體，并將單克隆抗體VH4進(jìn)行了膠體金標(biāo)記，作為檢測抗體，多克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測哈維氏弧菌的膠體金試紙條。該方法的檢測限略低于斑點雜交，大約為100萬CFU/mL。但是將哈維弧菌在T培養(yǎng)基中培養(yǎng)6h以上，可以將靈敏度提高到1~10CFU/mL。該方法簡單、方便，普通人員可以在沒有設(shè)備的池塘直接進(jìn)行檢測。
　　創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)是海水養(yǎng)殖蝦、蟹等水生動物中常見的致病菌，廣泛分布于海水中。嚴(yán)志敏等用13nm的膠體金顆粒標(biāo)記創(chuàng)傷弧菌多克隆抗體噴涂在金標(biāo)墊上，采用夾心法即在檢測線上噴涂多克隆抗體，質(zhì)控線上噴涂二抗，建立了檢測創(chuàng)傷弧菌的膠體金檢測試紙條。該試紙條特異性強(qiáng)、對創(chuàng)傷弧菌的   低檢出限為200萬CFU/mL，該試紙條40C可保存4個月之久，檢測時間僅需20min，適合臨床及現(xiàn)場檢測。
　　霍亂弧菌(V.Cholerae)是引起人類霍亂的病原體。海洋甲殼類動物可作為其宿主，散播病原菌，造成霍亂流行。何艷玲等研究了采用夾心法，即用膠體金標(biāo)記霍亂弧菌單克隆抗體，NC膜的檢測線和質(zhì)控線上分別包被霍亂弧菌多克隆抗體和羊抗鼠IgG，并通過對試紙材料的優(yōu)化處理，建立檢測食品中O1群霍亂弧菌的膠體金免疫層析方法。該方法檢測的靈敏度為10萬CFU/mL，特異性良好，假陽性率為6.25%，適用于對水產(chǎn)品O1群霍亂弧菌的檢測。謝昭聰?shù)纫膊捎脢A心法建立了水產(chǎn)品中霍亂弧菌的檢測方法，該試紙條的   低檢出量為10萬CFU/mL，通過改良增菌培養(yǎng)液成分，提高待檢菌繁殖能力，即可檢測霍亂弧菌污染菌數(shù)較少的魚貝類。
　　自20世紀(jì)90年代對蝦白斑綜合征在全世界范圍爆發(fā)以后，對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)己成為對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害   大的病毒病原之一。
　　Sithigorngul等以膠體金標(biāo)記的抗WSSV結(jié)構(gòu)蛋白VP28的單克隆抗體W29作為檢測抗體，以抗WSSV重組蛋白Rvp28的多克隆抗體W29和羊抗鼠IgG作為捕獲抗體，制備了檢測WSSV的膠體金試劑條，雖然其檢測靈敏度比Dot-blot低4倍，比PCR低200萬倍，但是該試紙條特異性強(qiáng)、不需要的設(shè)備儀器，而且檢測所需時間短，15min便可出結(jié)果。Cheng等用大腸桿菌純化表達(dá)抗
　　WSSV重組蛋白VP(19+28)的多克隆抗體，并將純化后的多克隆抗體進(jìn)行了膠體金標(biāo)記用為檢測抗體，以未標(biāo)記的抗WSSV重組蛋白VP(19+28)多克隆抗體和羊抗兔IgG作為捕獲抗體分別噴涂在NC膜的T線和C線上，建立了WSSV膠體金免疫層析試紙條檢測方法，其   低檢測限為10ng/mL，特異性強(qiáng)。此外，Wang等用膠體金標(biāo)記的斑點免疫滲濾法(DIGFA)檢測WSSV，該方法簡單便捷，不需要任何設(shè)備，3min內(nèi)出結(jié)果，方便池塘養(yǎng)殖檢測。
　　對蝦黃頭病病毒(YHV)，1990年在泰國   報道，現(xiàn)己成為危害對蝦養(yǎng)殖業(yè)的三大病毒病病原(對蝦白斑病毒(WSSV)、陶拉綜合征病毒(TSV)、對蝦黃頭病病毒(YHV))之一。Sithigorngul等以膠體金標(biāo)記的抗YHV結(jié)構(gòu)蛋白p20的單克隆抗體Y19作為檢測抗體噴涂在金標(biāo)墊上、抗重組蛋白rp20的多克隆抗體和羊抗鼠IgG作為捕獲抗體分別噴涂與NC膜的T線和C線上，建立了檢測YHV的膠體金免疫層析試紙條，該試紙條的靈敏度比一步法RT-PCR低500倍，但高于Dot-blot，可用于的YHV或YHV爆發(fā)的初步檢測，因其單抗Y19與鰓聯(lián)病毒(GAV)有交叉反應(yīng)，因此該試紙條也可用于GAV的檢測。
　　淋巴病毒(LCDV)以其傳染性強(qiáng)、潛伏期長等特點己成為危害我國牙郵養(yǎng)殖業(yè)的一大難題。Sheng等以膠體金標(biāo)記的抗LVCV的單克隆抗體2D11作為檢測抗體噴涂在金標(biāo)墊上、單克隆抗體1A8和羊抗鼠IgG作為捕獲抗體分別噴涂與NC膜的T線和C線上，建立了檢測LVCV的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)1μg/mL，檢測時間低于10min，該試紙條在室溫下可保存6個月，4℃條件下可保存1年。